肝脏是药物代谢和毒性的重要器官，原代肝细胞（Primary Hepatocytes）因其完整的细胞特性及生理水平的酶和辅因子而被广泛应用于药物研究。原代肝细胞中不仅含有膜结合酶，例如细胞色素P450（Cytochrome P450），还包括胞质酯酶，涵盖了肝脏所有代谢途径。因此，原代肝细胞被视为构建体外肝脏模型的金标准，尤其是在药物相互作用、代谢及毒性研究方面备受青睐。本文将概述基于原代肝细胞的二维（2D）和三维（3D）培养模型以及它们在药物研发中的应用。

一、原代肝细胞的分离

原代肝细胞的分离常采用两步胶原酶灌注法。小型动物可通过门静脉或下腔静脉进行灌注，而大型动物则通常通过肝叶或肝段进行灌注。成功分离肝细胞的关键因素包括无细胞毒性的胶原酶、恰当的消化时机以及良好的肝脏状况。分离后，原代肝细胞需达到以下标准才能用于药物研究：1、实验开始时活率应为80%，并在实验过程中保持活率下降小于20%；2、应检测2-3种已知药物的代谢，与文献值相符；3、使用典型诱导剂，例如利福平，需使CYP3A4活性增加至少3倍；4、冻存肝细胞接种4-6小时后的贴壁率应为70%。

二、原代肝细胞的二维（2D）培养

悬浮肝细胞（Suspension Hepatocytes）模型能保留完整的药物代谢酶和辅助因子，然而随着体外孵育时间的增加，其活率和酶活性会逐渐降低，因此限制了最长孵育时间为4小时，主要用于估计中高清除速率药物的代谢。为了克服这一限制，可采用悬浮肝细胞的接力方法，使孵育时间延长至20小时以上，适用于小分子药物的酶活性及代谢稳定性研究。原代肝细胞的2D培养在胶原蛋白包被的培养基表面进行，然而由于缺少相关细胞类型，所提供的营养和旁分泌因子可能不足，限制了其功能。值得注意的是，贴壁肝细胞在不适宜的铺板密度下，可能导致酶的基础表达降低，从而引发较强的诱导反应。

三、原代肝细胞的三维（3D）培养

球状体（Spheroid）模型利用超低粘附培养等技术，使原代肝细胞形成独立的球团，以保持细胞的活性和功能。这种培养方式相较于传统的三维培养方法，显著减少了对细胞数量的需求。与三明治培养相结合，能够有效捕捉药物吸收、分布、代谢和排泄的相关酶的活性。在此模型中，肝细胞可重新获得极性，从而促进功能性胆管网络的形成，有助于更真实地反映肝脏的功能。

四、原代肝细胞的共培养模型

基于原代肝细胞的共培养模型通过将不同类型的细胞混合培养，能够增强细胞间的相互作用，这对于研究药物代谢、作用机制以及肝脏的适应性反应非常重要。通过与成纤维细胞及非实质肝细胞的共培养，可以更全面地评估药物对肝脏的影响，以及细胞因子在肝损伤中的作用。

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