细胞凋亡检测是一项在生物医学研究中极其重要的技术，广泛应用于疾病机制、药物筛选等多个领域。本文将详细介绍如何使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒来进行有效的细胞凋亡检测。

实验原理

在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会转移到细胞外侧，暴露于外部环境中。此外，细胞膜的通透性也随之增加，使得PS能够被特异性结合的Annexin-V探针标记。Annexin-V为一种钙离子依赖性的脂质结合蛋白，与PS结合的能力极强。而PI（碘化丙锭）则是一种经济且稳定的核酸染料，它无法穿透正常或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但可穿透晚期凋亡和坏死细胞，导致细胞核染成红色。在联合使用AnnexinV与PI时，PI能够排除活细胞和早期凋亡细胞的干扰，而晚期凋亡细胞与坏死细胞则会同时被FITC和PI染色，表现为双阳性。

实验材料准备

• AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒
• 细胞样本（悬浮细胞或贴壁细胞）
• 离心机
• PBS缓冲液
• 荧光显微镜或流式细胞仪

实验方法

1. 细胞收集

悬浮细胞：以1000g离心5分钟，弃去上清。加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，再以1000g离心5分钟，去掉上清，保留细胞沉淀。

贴壁细胞：小心吸取细胞培养液保存备用，加入PBS洗涤后，添加适量的胰酶消化液（避免使用EDTA，以免影响AnnexinV与PS的结合），消化细胞。将之前收集的培养液加入，轻轻吹打细胞，形成单细胞悬液，1000g离心5分钟，弃去上清，并用1mL预冷的PBS重悬细胞沉淀，再次离心，保留细胞沉淀。

2. 重悬细胞

将细胞沉淀重悬于195μL Binding Buffer中，轻轻混匀至适宜浓度。

3. 加入染料

1. 加入5μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀，以检测早期凋亡细胞（磷脂酰丝氨酸外翻）。
2. 加入10μL PI Stain，轻轻混匀，以检测晚期凋亡或坏死细胞（DNA染色）。

4. 孵育

在室温下避光孵育10-20分钟，确保染料与细胞充分结合。

检测与分析

流式细胞仪检测

1. 设置合适的通道以检测AnnexinV-FITC和PI的荧光信号。
2. 设定三组对照以校正背景信号，准确确定凋亡细胞比例：未染色组（测定自然荧光），PI单染组（确定PI的阳性阈值），AnnexinV-FITC单染组（确定AnnexinV的阳性阈值）。

荧光显微镜检测

1. 离心后用Binding Buffer重悬细胞并制成涂片。
2. 在荧光显微镜下观察，AnnexinV-FITC发出绿色荧光，PI发出红色荧光。
3. 通过拍照或计数定量分析凋亡细胞比例。

注意事项

• 在整个操作过程中应尽量保持低温，以减少细胞代谢和自发荧光。
• 避免长时间曝光于光线下，特别是FITC类染料，以防止荧光淬灭。
• 根据实验需求调整细胞数量和染料浓度。
• 若使用流式细胞仪，请确保仪器已校准并且通道设置正确。

通过以上方法，研究人员可以有效利用鸿运国际提供的细胞凋亡检测试剂盒，进行高效、准确的细胞凋亡检测，为生物医学研究提供有力支持。