在之前的两期中，我们重点介绍了细胞转染及慢病毒转染的基本内容。本期，我们将进一步探讨慢病毒转染的实验操作、注意事项及常见问题。

一、慢病毒实验步骤

慢病毒的实验流程大致可分为四个主要步骤：质粒构建、病毒包装、病毒收集与浓缩，以及感染靶细胞、筛选与验证。

1. 质粒构建

首先，需要构建重组质粒，将外源目的基因片段插入质粒载体，以获得重组质粒。这一过程需要在大肠杆菌中进行转化并提取重组质粒DNA。

2. 病毒包装

将重组质粒DNA与其他包装质粒按说明书的比例共转染293T细胞，分别在48小时和72小时后收获含病毒的上清液。

3. 病毒收集与浓缩

对收集的含病毒上清进行3000rpm离心20分钟，使用045um滤膜过滤以去除细胞沉淀。接着，将上清液进行12000rpm离心以初步浓缩并分装，在-80°C保存。必要时，需进行滴度测定以检验目的基因的存在。超速离心法和PEG沉淀法均可有效浓缩病毒，但超速离心设备要求较高，而PEG沉淀法虽然操作简单且成本低，但效率较低。

4. 慢病毒转染细胞

第一天：以293T细胞为例，消化收集状态良好的目的细胞，通过细胞计数调整密度至1x10⁵个/mL，并接种至24孔板，每孔加0.5mL，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。由于不同细胞的生长速度不同，细胞接种量也应相应调整。通常，确保接种后第二天细胞的融合度在30%-50%即可。

第二天：在培养过程中观察293T细胞的生长情况，吸去旧培养基，加入提前预热的新鲜完全培养液，每孔加0.25mL，继续在37℃、5% CO₂培养箱中培养4小时。操作时需轻柔，避免吸走细胞或造成细胞漂浮。4小时后补加0.25mL新鲜培养液，继续培养。注意：部分孔不加病毒，作为对照组。

第三天：转染后的第二天，即加入病毒后24小时，需显微镜观察细胞状态并记录。若无异常，吸去含病毒的培养液，补加新鲜完全培养液继续培养。

第四至六天：需要观察转染效果。如果转染的慢病毒带有荧光标记，可以在转染后48小时，通过倒置荧光显微镜检查荧光强度来初步评估转染效果。此外，也可以这时加入适宜浓度的puromycin或其他筛选药物，以筛选出成功转染的细胞。对于生长缓慢的细胞，观察时间可延长至96小时。

二、慢病毒实验注意事项

在进行慢病毒转染时，有若干注意事项需要遵循：

• 病毒的保存：短期内可在4℃冰箱保存（不超过一周），长期应分装后在-80℃冰箱中保存，不超过6个月。使用时需在冰上融化，避免反复冻融影响病毒活性。
• 细胞状态：应选择生长于对数期的细胞进行转染，以保证转染效率。
• 细胞接种量：应根据细胞增殖速度及所用培养器皿的大小来决定，通常在转染前确保细胞密度在30%-50%之间。
• MOI值：MOI值较高时，细胞转染难度增加，因此需在转染前进行细胞计数并计算接种量。
• 文献查找：转染前需查阅相关文献，了解靶细胞的培养条件、生长速度、MOI值及药物筛选参数等，以优化转染条件。
• 转染后观察：需要定期观察细胞状态。如果转染48小时后细胞密度较大，可进行传代，等细胞附壁或稳定后再进行药物筛选。
• 观察时间：通常在转染后48-72小时观察，对生长缓慢细胞可适当延长观察时间。

三、实验常见问题

Q1: 如何提高慢病毒对细胞的感染效率？

感染效率受多种因素影响，包括细胞状态、接种数量及MOI等。保证细胞状态良好和适当的接种密度能够显著提高感染效率。

Q2: 如果转染后细胞死亡，应该怎么办？

细胞死亡可能与感染效率低下有关。确保细胞状态良好和适当的实验条件是关键。

Q3: 瞬时转染与稳定转染的区别？

不论是瞬时还是稳定转染，DNA均会进入细胞核，并有一定几率随机整合到宿主染色体。稳定转染可通过药物筛选来保留成功转染的细胞，而瞬时转染不具此优势。

Q4: 慢病毒转染时的细胞接种量应该是多少？

细胞接种量应根据细胞增殖速度和培养容器大小进行调整，确保在感染后4天左右细胞能达到适宜汇合度。

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